本成果是“十一五”国家科技支撑计划项目（2008BADB2B01）和中国农科院（CAAS）－国际家畜研究所（ILRI）联合研究项目：动物遗传资源的分子评价（2008-CI-03）中旧院黑鸡研究的成果。并且后期2020年达州市科技计划项目-《利用基因组标记挖掘和保护原产地旧院黑鸡优异遗传资源》将继续跟进研究。
一、任务来源及项目简介(计划项目应写明计划名称及编号，计划外的应说明是横向委托或自选项目，简要说明项目立项背景（研究背景）、总体思路、主要研究内容、关键技术及技术路线)
一、立项背景（研究背景）
旧院黑鸡因产于川东北的大巴山深处--四川省达州市万源旧院镇而得名，在1963年被中科院西南综合考察组发现；邱祥聘教授曾认为旧院黑鸡是继南美洲智利地区之后的世界上能产绿壳蛋的另一鸡种（罗增伟，2001）。旧院黑鸡具有体格大、前期生长较快、出肉率高的特点，不失为一个耐粗耐寒的优良地方鸡种；1982年被定为四川省地方优良品种，1983年定为全国地方优良品种，先后被收录到《四川家畜家禽品种志》、《中国农业文库》、《中国家禽地方品种资源图谱》和《中国畜禽遗传资源志·家禽志》等学术专著。四川省畜科院等高校科研所研究证明，得益于当地独特的地理环境，该鸡富含硒元素，而人长期摄入硒元素，能起到抗癌和延缓衰老的功效；其绿壳鸡蛋更是营养丰富，被称为“鸡蛋人参”，市场价3-8元/枚，约是普通鸡蛋价格的3-8倍。旧院黑鸡被中科院命名为：“世界稀有，中国独有，万源特有”，具有不可复制性。经四川省农科院中心实验室测定，发现该鸡肉质细嫩清香，味道鲜美，其氨基酸、微量元素、黑胶素和紫色素等含量与丝羽乌骨鸡相似（李平，2006）。旧院黑鸡已经通过了有机产品质量认证，并获农业部农产品地理标志认证保护。
随着我国优质鸡从生产、育种再到生产的不断深入和发展，丰富的地方鸡种品种资源优势也正逐步转化为市场经济的商品优势。经四川农业大学动物营养研究所对旧院黑鸡肌肉的营养成份进行测定，表明该鸡的氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、钙、磷的含量均高于其它土鸡，具有很好的市场开发前景（王俐智，2008）；并且刘福柱等人通过与白羽略阳鸡、黑羽略阳鸡及泰和鸡的比较，发现旧院黑鸡肌肉的蛋白质和氨基酸的含量均较高（刘福柱，1992）。胡小方等人通过研究笼养、平养、茶园散养对旧院黑鸡蛋品质及营养成分的影响，发现平养条件下的鸡蛋氨基酸营养价值最好，茶园散养的鸡蛋在新鲜度、胆固醇、卵磷脂含量及食品风味上更优（胡小方，2019）。旧院黑鸡绿壳蛋的蛋壳强度极显著高于褐壳蛋和白壳蛋（杨昌明，1989），且旧院黑鸡绿壳蛋对白壳蛋呈显性遗传（蒋小松，1990）。国内外研究表明，HP-EAV的整合诱导了SLOCB3基因的表达，从而导致鸡产绿壳蛋（Wang Z，2013）；而酪氨酸酶第4内含子中整合的禽白血病病毒（ALV）DNA序列，导致鸡的酪氨酸酶基因出现了一个全新的等位基因，呈隐性遗传，如有携带ALV整合的纯合子个体表现为白羽（Chang Chung-Ming，2006）。四川旧院黑鸡是四川省万源市特有的地方品种，其最显著的特征为乌皮、黑羽、豆冠、黑胫。在其自然群体中，约有5%的个体产绿壳蛋（徐桂芳等，2003b），旧院黑鸡散养历史较长，受到混养外来品种的杂交影响，发生了遗传漂移，品种退化严重。建立的原种场由于保种资金投入不足，仅起到了机械性的保护作用，保种力度不够，也没有真正去挖掘旧院黑鸡品种本身存在的优良价值和特色性状基因，中国农业大学吴常信院士、中国农科院北京畜牧兽医研究所马月辉教授等在利用畜禽遗传资源受威胁评价方法对我国地方畜禽资源进行研究时，发现许多地方畜禽遗传资源仍然受到严重地潜在威胁（马月辉，2001）。旧院黑鸡是我国畜禽遗传资源中宝贵的种质资源基因库，但目前通过基因组学方法在原产地（四川省达州市万源市）范围内挖掘、研究和定向选育旧院黑鸡的研究还是空白，因此，利用基因组学方法挖掘、研究和保护旧院黑鸡种质资源，对于我市乃至我省的畜禽种质资源研究保护和利用等具有深远的战略意义。
目前，国际上“生物物种资源主权”争夺愈演愈烈，依法保种刻不容缓，保种的目的不光光是保存，而是充分有效的利用，利用是最好的保存（张丹萍，2013）。四川省“十三五”农作物及畜禽育种攻关实施方案中将种质与基因资源的收集、保存、创制、鉴定和畜禽水产新品种（配套系）选育纳入攻关任务。因此由达州市畜牧技术推广站牵头，国际家畜研究所（LIRI）以及中国农科院北京畜牧兽医研究所（IAS CAAS）共同参与首次研究EAV-HP和ALV在旧院黑鸡群体基因组中插入整合分布情况。
二、总体思路和主要研究内容
选出旧院黑鸡群体中性状一致、特点明显的旧院黑鸡；采用双重PCR对EAV-HP和ALV的插入整合进行检测，用DNA测序序列比对与分析，从而分析序列中的突变位点；通过单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism,SSCP)或测序方法，分析EAV-HP和ALV这两个的识别位点；利用PCR技术检测不同群体中EAV-HP和ALV的整合情况，可以全部筛选出绿壳蛋鸡群中少量存在的隐形白羽杂合子个体，实现快速检测、筛选纯系绿壳蛋旧院黑鸡。
二、应用领域和技术原理
动物遗传标记经历了从形态特征一血液蛋白多态性一DNA多态性的过程，它在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。分子标记(Molecular Markers )，是指利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行的选择。在DNA水平对遗传多态性的直接反映，可以在早期对目标基因进行准确、稳定的选择。与常规选种方法相比，可以早期选育，缩短世代间隔，加快育种进程，降低育种成本，提高选择的准确性，不受环境影响，遗传稳定性高，检测手段简单，具有共显性好，不影响目的性状表达，不同发育阶段和不同组织的DNA都可以用来分析等优点。
我们和国际家畜研究所（ILRI）以及中国农科院北京畜牧兽医研究所（IAS CAAS）通过对部分旧院黑鸡以及其它4个绿壳蛋鸡的研究，即5个绿壳蛋鸡群体中EAV-HP在SLCO1B3基因5′-非编码区插入整合频率和类型的研究中发现经过初步选育的旧院黑鸡群体中携带较高频率的HP-EAV整合，HP-EAV以反向插入的方式，整合在SLCO1B3基因的5’-非编码区，从而启动了SLCO1B3基因在卵壳腺中的特异性表达，运输胆绿素沉积在蛋壳上，完全符合绿壳蛋形成的分子遗传学机制；但其中也存在少数携带ALV整合的杂合子个体，ALV插入整合在TYR基因的第4内含子中，导致TYR基因的转录产物的异常表达，从而形成隐形白羽性状。利用这2个位点的EAV-HP和ALV作为分子标记，采用双重PCR方法，检测旧院黑鸡群体，绿壳蛋率28.90%，LC基因频率为17.68%。ALV在旧院黑鸡群体中有少量分布，C基因的频率均较低为3.44%。因此，针对绿壳蛋鸡基因组中的绿壳基因和隐性白羽基因，可以利用双重PCR方法进行分子辅助选择育种。
三、性能指标（检测报告中数据为准）
1. HP-EAV以反向插入的方式，整合在SLCO1B3基因的5’-非编码区，从而启动了SLCO1B3基因在卵壳腺中的特异性表达，运输胆绿素沉积在蛋壳上，导致产绿壳蛋；
2. ALV插入整合在TYR基因的第4内含子中，导致TYR基因的转录产物的异常表达，从而形成隐形白羽性状。
四、与国内外同类技术比较
Wang等（2013）和Wragg等（2013）首次发现了绿壳蛋形成的分子机制，即内源性逆转录病毒EAV-HP元件以反向插入的方式，整合在有机阴离子转运体1B3基因（Solute carrier organic anion transporter family member 1B3, SLCO1B3）的5‟-非编码区，从而启动了SLCO1B3基因在卵壳腺中的特异性表达；他们还发现中国的东乡绿壳蛋鸡和卢氏鸡与智利的Mapuche（即Araucano）鸡的绿壳性状的形成是两个相互独立的进化事件，即这两个地方的EAV-HP在SLCO1B3基因的5‟-非编码区插入整合的位点不同（Wang et al., 2013; Wragg et al., 2013）。
由达州市畜牧技术推广站牵头，国际家畜研究所（LIRI）以及中国农科院北京畜牧兽医研究所（IAS CAAS）共同参与首次在旧院黑鸡群体中研究EAV-HP和ALV在旧院黑鸡群体基因组中插入整合分布情况。
五、成果的创造性、先进性
旧院黑鸡是我国畜禽遗传资源中宝贵的种质资源基因库，但之前通过基因组学方法在原产地（四川省达州市万源市）范围内挖掘、研究和定向选育旧院黑鸡的研究还是空白，因此，利用基因组学方法挖掘、研究和保护旧院黑鸡种质资源，对于我市乃至我省的畜禽种质资源研究保护和利用等具有深远的战略意义。
由达州市畜牧技术推广站牵头，国际家畜研究所（LIRI）以及中国农科院北京畜牧兽医研究所（IAS CAAS）共同参与首次在旧院黑鸡群体中研究EAV-HP和ALV在旧院黑鸡群体基因组中插入整合分布情况，填补了国际国内的这项空白。
六、作用意义（直接经济效益和社会意义）
旧院黑鸡是我国畜禽遗传资源中宝贵的种质资源基因库，但之前通过基因组学方法在原产地（四川省达州市万源市）范围内挖掘、研究和定向选育旧院黑鸡的研究还是空白，因此，我们首次在旧院黑鸡群体中研究EAV-HP和ALV在旧院黑鸡群体基因组中插入整合分布情况，填补了国际国内的这项空白。利用基因组学方法挖掘、研究和保护旧院黑鸡种质资源，对于我市乃至我省的畜禽种质资源研究保护和利用等具有深远的战略意义。
畜禽遗传资源的保护主要为了开发利用，单纯的保种而不利用，既不现实也不长久。保护和开发利用的协调发展，才可促进资源优势和产业优势相融合，本成果以经济效益优良、种质特性优异的旧院黑鸡品种为核心，以区域特色明显、养殖传统悠久的万源市为重点，通过产学研融合推动传统产业转型升级，开展融遗传资源保护与利用为一体的畜禽遗传资源保护新途径；使畜禽遗传资源的保护与育种公司的商业育种结合在一起，使遗传资源的保护与利用能够可持续开展。解决制约地方畜禽遗传资源保护与利用工作发展的技术瓶颈，提升资源保护与利用科技创新水平，促进了旧院黑鸡的开发利用，间接达到保种的目的。
七、推广应用的范围、条件和前景
旧院黑鸡因产于川东北的大巴山深处--四川省达州市万源旧院镇而得名，被中科院命名为：“世界稀有，中国独有，万源特有”，具有不可复制性。旧院黑鸡是我国畜禽遗传资源中宝贵的种质资源基因库，但之前通过基因组学方法在原产地（四川省达州市万源市）范围内挖掘、研究和定向选育旧院黑鸡的研究还是空白，因此，我们首次在旧院黑鸡群体中研究EAV-HP和ALV在旧院黑鸡群体基因组中插入整合分布情况，填补了国际国内的这项空白。
旧院黑鸡绿壳鸡蛋营养丰富，被称为“鸡蛋人参”，市场价为3-8元/枚，约是普通鸡蛋价格的3-8倍。2019年万源市旧院黑鸡年存栏170万只，出栏460万只，产蛋母鸡90万只，一只旧院黑鸡产蛋母鸡年平均产蛋140枚，通过该项研究成果进行纯系绿壳蛋旧院黑鸡核心群的建立扩繁和大面积推广，仅在四川省达州市万源市就旧院黑鸡鸡蛋一年可增收7.5726亿-12.8646亿元的可观收益。后期研究成果也可推广到养殖绿壳蛋鸡的其它地区，将带来难以估量的巨大的经济效益和社会效益。选育出的纯种群也为贫困户、旧院黑鸡养殖户和企业带来持续地经济效益，从而帮助农民增收、产业增值、企业增效、乡村振兴。