一、任务来源及项目简介(计划项目应写明计划名称及编号，计划外的应说明是横向委托或自选项目，简要说明项目立项背景（研究背景）、总体思路、主要研究内容、关键技术及技术路线)
计划名称：Ripk1/Parkin调控细胞自噬参与结直肠癌的发生发展过程的分子机制研究
编号：81902861
来源：国家自然科学基金青年项目
 
项目立项背景：
结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是世界范围内第三大最常见的恶性肿瘤之一，在肿瘤相关死亡的病因中排第四位。全球每年新增被诊断为结直肠癌的病人超过一百万人。近年来发现在某些结直肠癌发病率较低的地区例如东欧和东亚地区，该病发病率呈现上升趋势。在我国，结直肠癌的发生率和死亡率分别位于第三位和第五位，并逐年上升。结直肠癌晚期患者生存率不到10%。大约75%-80% CRC的发生都伴随着某些基因突变和表观遗传修饰，这些基因主要包括 TP53、KRAS、BRAF、PIK3CA、APC和 PTEN等。但是，结直肠癌的具体发病机制仍不清楚，研究结直肠癌相关的靶向分子和细胞活动，对于结直肠癌的治疗具有重要意义。
近期研究表明，自噬在结直肠癌的发病中具有一定作用。自噬相关基因ATG12通过一种微小RNA miR-214可以调节CRC的放射敏感性，即抑制ATG12介导的自噬反应可以增加癌细胞对射线的敏感性，有利于CRC治疗；另一种微小RNA miR-221可以抑制自噬，促进CRC细胞增殖。结直肠癌中的自噬反应也可接受胰岛素样生长因子系统的调节作用。一种小分子GL-V9可以通过调节自噬减缓肠道炎症发展为结直肠癌的进程。以上研究提示细胞自噬可以通过多种途径影响CRC的发生和发展，二者之间具有密切联系，但目前仍然争论不断，自噬在CRC中的作用仍不清楚。
研究还发现Parkin在胶质母细胞瘤和结肠癌细胞系中的过度表达可以抑制细胞生长，而在胰腺癌细胞中低表达Parkin和小鼠模型中敲除Parkin可以促进癌细胞的增殖和致瘤性。以上研究发现推测PARK2基因可能是一个抑癌基因。Parkin蛋白通过介导错误折叠蛋白质Lys63连接的多聚泛素化诱导自噬，并促进这些蛋白的清除。Parkin可以选择性的被招募到 损伤的线粒体，促进异常线粒体的自噬。据报道，在散发的CRC患者中，经常可以发现PARK2基因的缺失，提示Parkin与CRC的发生发展可能存在某种联系。近年来，关于Parkin与细胞自噬之间的关系受到众多研究者的关注，并获得了显著的研究成果。但是，Parkin参与自噬的分子机制仍不清楚，其在CRC的功能还有待深入研究。
目前，关于结直肠癌的发病机理仍不清楚，治疗的手段十分受限，且晚期生存率低。细胞自噬作为重要的细胞应激方式，其在细胞增殖和细胞死亡中所起的作用仍然有争议，已有的文献报道也主要集中在其本身的通路与癌症的关系，对于其可能的信号通路协同调节仍未有报道。我们前期的实验中已观察到结直肠癌自噬信号增强，Ripk1在结直肠癌中高表达，而Parkin低表达，并且通过免疫共沉淀，我们发现两个分子可以直接相互作用，提示了一条潜在的自噬新通路。因此阐明 Ripk1/Parkin在结直肠癌中作用的分子机制，可以为其治疗提供新的靶标。针对该靶点设计小分子药物或设计细胞治疗方案，可以丰富治疗方法，为患者提供更多治疗选择。综上所述，本研究旨在对结直肠癌的发病机理进行深入探索，为结直肠癌的临床治疗提供新的靶标和策略，以期增加结直肠癌的治疗方法和总体获益，改善结直肠癌患者的预后。
 
总体思路：
首先通过人群样本利用转录组测序确定Ripk1和Parkin在不同分期的结直肠癌患者中的表达谱以及与预后的关系。之后进行基础实验，探讨Ripk1和Parkin的上下游关系与Ripk1和Parkin的相互结合关系，揭示两者对细胞自噬调控的分子机制。最后利用利用裸鼠荷瘤及化学诱导肠癌模型从在体水平验证Ripk1和Parkin对结直肠癌发生和发展的作用。
 
主要研究内容：
为了研究Ripk1和Parkin 在结直肠癌患者中的表达情况，我们计划收集不同病理分期的结直肠癌患者的癌旁正常组织和癌组织，观察相关的分子的转录水平和蛋白水平的变化情况，并对其预后情况进行跟踪随访。a、选取液氮冷冻的组织进行样本建库，采用高通量测序平台对结直肠癌组织与癌旁正常组织进行转录组测序，获取差异表达基因图谱；分析Ripk1和Parkin及其相关细胞自噬通路蛋白的基因表达情况。b、组织样本提取mRNA与蛋白，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和免疫印迹法（Western blot）等分子生物学手段确认结直肠癌患者中Ripk1和Parkin 及其相关自噬通路蛋白的mRNA和蛋白水平表达情况。c、选取多聚甲醛固定的样本，利用免疫组化的方法，进一步确认Ripk1和Parkin的表达情况以及和结直肠癌分期之间的关系，并通过随访数据，确定其与预后的关系。
在结肠癌细胞系HT29和CT26中利用siRNA系统敲除Ripk1和Parkin，利用RT-PCR和Western blot等分子生物学手段观察两者mRNA和蛋白变化，通过细胞计数和划痕实验探究细胞增殖和迁移情况。同样的，利用腺病毒转染Ripk1和Parkin，观察过表达对于细胞增殖和迁移的影响。为了证明Ripk1和Parkin对于细胞自噬通路的影响，通过过表达和敲除Ripk1和Parkin，在分子层面，检测细胞自噬的标志物（LC3）和自噬通路相关蛋白（ATG、PINK1、P62 等）的表达情况；在形态学层面，通过电镜观察细胞中自 噬小体的情况从而确认其是否调控细胞自噬。
在结肠癌细胞系HT29和CT26中利用腺病毒转染系统，分别过表达 Ripk1 和 Parkin，同样检测Ripk1和Parkin 的变化，从而确定Ripk1和Parkin的上下游关系。利用Adv-GFP-Ripk1和Adv-RFP-Parkin转染HT29，在共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope）的不同激光照射下会发出绿色荧光（Ripk1）和红色荧光（Parkin），看两者Merge情况从而确认Ripk1和Parkin的亚细胞定位，判断Ripk1和Parkin是否存在共定位。
通过构建载有Ripk1和Parkin不同关键区域突变的表达质粒（磷酸化位点突变、泛素化位点突变、剪切位点突变以及乙酰化位点突变等），通过过表达在HT29细胞以及CT26细胞，结合免疫共沉淀方法，比较突变位点和野生型相互结合情况，从而确定哪一个位点影响Ripk1和Parkin的相互作用。
研究Ripk1和Parkin 在小鼠模型中对结直肠癌发生和发展的作用。为了验证细胞实验结果，我们采用了裸鼠荷瘤及化学诱导结肠癌模型的在体模型。首先构建稳定高表达和敲除Ripk1和Parkin的细胞系，为裸鼠接种1×10⁷/0.2 mL/site的细胞，观察和记录肿瘤的体积和质量。
 
关键技术及技术路线：

二、应用领域和技术原理
1. 纳入排除标准：
（1） 纳入病理诊断为结直肠癌的患者；
（2） 年龄在18-80岁之间的患者；
（3） 样本临床病历资料完整，无其他恶性肿瘤及重大疾病。
2. 转录组测序：
使用TRIZOL试剂(Takara Biomedical Technology，中国北京)提取总RNA。使用安捷伦2100 RNA Nano 6000检测试剂盒(安捷伦科技，CA，美国)检测总RNA的完整性和浓度。总RNA样本合格后，选择带oligo (dT)的磁珠进行富集纯化。合成的链用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化，EB缓冲液洗脱。然后，对纯化的双链cDNAs进行端修复、碱基A和测序连接。目的片段经琼脂糖凝胶电泳提取，PCR扩增。采用PE150测序策略的Illumina平台对合格的文库进行测序。从Illumina平台测序中获得的原始reads通过去除低质量的序列和联合污染得到高质量的序列(clean reads)。随后的分析是基于高质量的序列。
使用R Studio(版本:3.6.1)中的DESeq2包分析差异表达基因。选择|log2Fold change|≥1, p-adjust值< 0.05作为差异基因的筛选标准。
使用GO数据库来分析DEGs的功能富集情况，重点关注与这些基因相关的途径，即生物过程、分子功能和细胞成分的富集情况。使用KEGG pathway数据库测定DEGs的富集情况。默认富集结果的超几何分布检验阈值为0.05。差异基因的PPI网络是根据使用STRING数据库(https://string-db.org/)获取的信息构建的。为了识别PPI网络中的hub基因，对cytoHubba(一个Cytoscape插件)进行了最大集团中心性分析。最大集团中心性是一种有效筛选枢纽基因的拓扑分析方法
1. 免疫组化：
将CRC患者石蜡包埋的肿瘤及邻近正常组织切成4 mm厚的切片。使用蛋白抗体进行染色。IHC染色按照厂家说明进行。阳性细胞的百分比分类如下(百分比分数):< 5%(0),5% - -25%(1),(2)25 - 50%,50 - 75%(3),和> 75%(4),染色强度分类如下(强度评分):-(0),弱(1),中等(2)和(3)。最后的得分是由以下公式:总分=百分比分数×强度得分。
三、性能指标（检测报告中数据为准）
1. 我们鉴定出5,338个差异表达基因，其中2,078个基因表达上调，3,260个基因表达下调。CXCL8 mRNA的水平被发现是在肿瘤组织最显著变化的基因之一 (log2FC= 3.45, p-adjust)= 2.71×10-8。GO分析鉴定出对DEGs富集的GO项13,763个，其中显著富集的GO项1,697个，包括与分子功能、生物过程和细胞组分相关的GO项。分子功能分析表明，前两项的差异基因与分子结合(GO:0005488)和催化活性(GO:0003824)有关。在生物过程类别中，大多数DEGs与细胞过程相关(GO: 0009987)。对DEGs进行KEGG通路分析，得到q值< 0.05的通路62条其中6个富集最显著的通路分别为神经活性配体-受体相互作用、昼夜节律诱导、ecm -受体相互作用、胰岛素分泌、蛋白质消化吸1. 收和细胞因子受体相互作用，其中富集的DEGs分别为93、43、37、37、37和67个。
2. 结直肠癌患者中Parkin 显著下降,低表达 Parkin 预后更差。TCGA 数据库中结直肠癌的表达量显著降低（P<0.05）(CRC（N=275）VS Control（N=349）); 生存曲线分析发现，结直肠癌患者低表达 Parkin 的预后更差。
3. 对50例结直肠癌的癌组织和癌旁组织进行免疫印迹法分析，发现结直肠癌组织中RIPK1显著增高，Parkin显著下降。N=50, *p < 0.05, ***p < 0.001; Normal VS CRC, student’s t-test.
4. 对6例癌旁正常组织和癌组织中分别使用RIPK1和Parkin 抗体去做免疫共沉淀，用Western blot检测复合物中的RIPK1和 Parkin，发现RIPK1和 Parkin 可以直接相互作用。
5. 在MEF（Mouse Embryonic Fibroblast）细胞中进行RIPK1敲除后，构建了Ripk1敲除的细胞系后Parkin表达量显著升高。
四、与国内外同类技术比较
Ripk1作为Ripk家族成员被发现以来，研究主要集中在Ripk1对细胞凋亡及坏死的调节机制和在免疫炎症方面的作用，但对于Ripk1在细胞自噬中的功能还不清楚。Parkin是一种E3泛素连接酶,在蛋白错误折叠集聚引起的疾病中具有重要作用，以往的研究也往往集中在帕金森病中，但在结直肠癌的发生和发展中研究较少。在我们现有的研究表明，结直肠癌患者的Ripk1蛋白水平明显上调，而Parkin蛋白水平明显下调，细胞自噬在结直肠癌患者中明显上调，三者具有明显的相关性，同时体外实验也显示在不同的结直肠癌模型中Ripk1和Parkin都明显变化，提示Ripk1和Parkin可能参与其中。对Ripk1和Parkin在结直肠癌发展过程中的功能进行研究，对阐明结直肠癌的发生发展的机理具有独创的意义。
五、成果的创造性、先进性
本研究将首次报道Ripk1和Parkin在结直肠癌的发生发展过程中的上下游关系和相互作用关系。目前，我们通过质谱分析和免疫共沉淀发现Ripk1和Parkin 可以直接相互作用，提示Ripk1和Parkin在结直肠癌中形成复合物，共同参与和执行了细胞的增殖和结直肠癌的发生和发展。更有意义的是，改变Ripk1可以改变Parkin的蛋白表达和影响细胞自噬，阐明Ripk1和Parkin在结直肠癌中的相互作用关系和修饰方式是本项目的创新之处。
本研究基础与临床结合，重在临床应用转化。本研究中心已经建立人类结直肠癌样本库和临床高通量测序中心，并且具有详细的随访数据，目前已积累近千例结直肠癌组织样本资源。依托此基础，采用高通量测序技术结合生物信息学分析方法，在组织、细胞、蛋白和基因等多个层面展开研究，将深入探究Ripk1和 Parkin在人群中的蛋白表达、预后联系及位点突变情况，评估其作为结直肠癌药物靶点和临床诊断的可能，实现从基础研究向临床应用的转化。
六、作用意义（直接经济效益和社会意义）
结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一。在我国，结直肠癌的发生率和死亡率分别位于第三位和第五位，并逐年上升。结直肠癌晚期患者生存率不到10%。大约75%-80%结直肠癌的发生都伴随着某些基因突变和表观遗传修饰，研究结直肠癌相关的靶向分子和细胞活动，对于结直肠癌的治疗具有重要意义。本课题利用结直肠癌细胞系和转基因小鼠，进一步研究Ripk1和Parkin相互调控关系，并深入探究两者在结直肠癌发生发展中的作用和作用机理。为结直肠癌指导用药提供理论依据，为对现有治疗不敏感的结直肠癌患者的治疗寻找新的靶点。
成果的推广可以在一定程度上使这类患者获益。
七、推广应用的范围、条件和前景
本课题成果的社会效益潜力巨大。每年结直肠癌全世界约有100万人患有结直肠癌，超过49万人死于结直肠癌。一般来说，结直肠癌早期患者的预后比结直肠癌晚期患者的预后更好。例如，早期结直肠癌患者的5年生存率大约是90%，而四期结直肠癌患者的5年生存率≤12%。因此明确结直肠癌的发生发展过程中的具体分子机制对于改善结直肠癌患者的生存质量，延长患者的生存期具有显著意义。本项目的研究成果目前已经进行了发表，对于结直肠癌患者，可以对患者Ripk1、Parkin、CXCL8等分子的表达进行检测。对于Ripk1、Parkin、CXCL8异常变化的结直肠癌患者，在进行传统放化疗的耐药时候，可以考虑针对以上分子及其受体的设计靶向小分子抑制药物，缓解患者的治疗耐受情况，延长结直肠癌患者的生存时间，提升患者的生存质量，具有十分显著的经济效益和社会效益。成果的推广可以在一定程度上使这类患者获益。