一、任务来源及项目简介(计划项目应写明计划名称及编号，计划外的应说明是横向委托或自选项目，简要说明项目立项背景（研究背景）、总体思路、主要研究内容、关键技术及技术路线)
课题名称：氟尿嘧啶血药浓度监测联合基因检测技术在结直肠癌化疗方案中的应用
编号：2018023
立项背景：5-氟尿嘧啶是结直肠癌患者普遍使用的基础化疗药物，5-FU本身没有抗肿瘤活性，在体内代谢成活性代谢产物5-氟-2-脱氧嘧啶核苷酸发挥作用。目前临床使用5-FU时多以患者体表面积计算患者5-FU用量，但并没有科学证据显示其合理性。宋卫峰等对192例晚期结直肠癌患者接受以5-FU为基础的FOLFOX(5-FU、亚叶酸钙和奥沙利铂)和FOLFIRI(5-FU、亚叶酸钙和伊立替康)方案作为一线和二线化疗。治疗过程中，依据患者的不良反应调整5-FU剂量，同时检测5-FU的稳态血药浓度。结果显示5-FU的血药浓度与持续输注剂量无关，与基于体表面积计算的持续输注剂量也无关。高5-FU血药浓度组(>30μg/L)患者的中位生存时间为31.4个月，低5-FU血药浓度组(<30μg/L)患者的中位生存时间为14.5个月。在高5-FU血药浓度组中，3－4级中性粒细胞减少和手足综合征更常见。也有研究表明关于个体的体表面积与5-FU的药代动力学的关系，研究显示二者之间并无关联。以体表面积的方法计算出的给药量，有研究表明在不同患者间可产生100倍左右的血药浓度差距，且在不同患者上其毒性与疗效均不同，尤其是毒性个体差异较大，甚至出现致死性的腹泻、骨髓抑制，而这种通过体表面积计算给药方案可能正是引起部分患者发生药物毒性反应和化疗效果差的重要原因之一。同时研究表明5-FU的代谢符合非线性药代动力学消除模式，5-FU的治疗效果和毒性反应与其实际血药浓度密切相关的。同时现在国内外在大量实验研究中也指出5-FU在体内合成、分解、代谢受基因多态性影响。通过对患者5-FU进行血药浓度监测同时结合患者临床症状，寻找出5-FU血药浓度与化疗毒性与疗效之间的关系，使临床个体化化疗成为可能。
总体思路：通过开展对患者5-FU血药浓度监测，结合患者化疗过程中的临床疗效与不良反应，经过统计分析相关数据，找出5-FU血药浓度、5-FU毒性与5-FU化疗疗效之间的关系。希望能找寻能5-FU的最佳治疗血药浓度范围，为肿瘤患者个体化化疗提供依据。
主要研究内容：我院60例经病理确诊的大肠癌患者,采取FOLFOX方案化疗,且每位患者的化疗周期均≥4周期。血样采取定于每周期化疗第2天早上6点统一采血，然后由科室护士专人负责送到药学部，采用高效液相色谱法(HPLC)对5-FU血药浓度进行检测,取各周期的血药浓度均值,根据5-FU血药浓度预测可信区间分为A组(≤20 mg/L)、B组(20~40 mg/L)和C组(>40 mg/L),比较三组患者的化疗疗效以及不良反应发生情况。
关键技术：1、如何开展5-FU血药浓度的测定？
结合我院实际情况，将联合第三方检验机构来开展实验研究，为实验的开展提供条件保障。血样前期处理好后将外包给南宁厚学致新科技有限公司检测。
2、疗效的评价标准：我们将联合医生严格按照NCCN指南来评价患者化疗疗效和毒性。
3、血药采集的准确性：我们将提前与肿瘤科的医生和护士沟通，商定好化疗时间，取血时间以及标本的储藏要求，尽量保证血样的合格性。
4、TDM需要患者用药一段时间后才能抽血测定药物浓度，采样的准确性直接影响测定结果；故患者的用药依从性尤为重要。临床药师可同过对患者进行用药教育和电话回访解决患者依从性的问题。
5、仅仅依靠血药浓度的测定尚不能求得一个合适的给药方案，医院的药师对患者的全面情况还缺乏了解，这对药师合理解释血药浓度监测的结果带来了很大的难度，只有在对患者的病理生理情况、用药情况、个体对药物的反应等方面充分了解的基础上才能使TDM工作开展得更有成效。这就要求我们的临床药师必须经常下临床，跟医生和患者多交流。
技术路线：选取合适的实验组和对照组→采集血标本→进行试验→整理数据→数据统计情况→撰写论文。大体上分三期：
一期：试验准备，并筛选合适的患者，分为实验组和对照组。
二期：收集血液，进行血药浓度监测，并记录患者的疾病控制况;
三期：整理数据，进行数据分析，撰写论文。
二、应用领域和技术原理
应用领域：当直肠癌患者用氟尿嘧啶化疗时可指导个体化给药。
技术原理：采用高效液相色谱仪测定
色谱柱：Waters-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液（5：95），等度洗脱8min，检测波长265nm，柱温25摄氏度，流速为1 mL/min，进样量体积为10L。
方法：精密称取5-氟尿嘧啶（5FU）及5-溴尿嘧啶（5Br）对照品适量，以50%甲醇水定容于10 mL容量瓶中，得1mg/mL 5-氟尿嘧啶和5-溴尿嘧啶储备液。从储备液中取适量5-氟尿嘧啶和5-溴尿嘧啶，用50%甲醇水定容于10mL容量瓶中，得20μg/mL的5-氟尿嘧啶和5-溴尿嘧啶的对照品溶液，置4℃冰箱保存。取5-氟尿嘧啶对照品溶液适量，分别配置成1、2、4、8、12、16、20μg/mL的5-氟尿嘧啶工作液，同时在工作液中加入100μL 5-溴尿嘧啶的对照品溶液。
标准曲线绘制。用5-氟尿嘧啶样品峰面积与5-溴尿嘧啶内标峰面积比（R）对样品浓度（c）作线性回归，计算回归方程。
三、性能指标（检测报告中数据为准）
三组化疗后不良反应比较
C组的骨髓抑制、黏膜炎等不良反应总发生率73.33%(11/15)高于A、B组的17.65%(3/17)、25.00%(7/28),差异具有统计学意义(P<0.05)；但B、C组在手足综合征发生率及胃肠反应比较差异无统计学意义(P>0.05)。
四、与国内外同类技术比较
国内已有探讨直肠癌患者5-FU给药剂量与血药浓度和疗效的关系的文献报道，宋卫峰等［3］对192例晚期结直肠癌患者接受以5-FU为基础的FOLFOX(5-FU、亚叶酸钙和奥沙利铂)和FOLFIRI(5-FU、亚叶酸钙和伊立替康)方案作为一线和二线化疗。治疗过程中，依据患者的不良反应调整5-FU剂量，同时检测5-FU的稳态血药浓度。结果显示5-FU的血药浓度与持续输注剂量无关，与基于体表面积计算的持续输注剂量也无关。高5-FU血药浓度组(>30mg/L)患者的中位生存时间为31.4个月，低5-FU血药浓度组(<30mg/L)患者的中位生存时间为14.5个月。在高5-FU血药浓度组中，3－4级中性粒细胞减少和手足综合征更常见。结论提示5-FU血药浓度监测对晚期结直肠癌患者可能是一种确定5-FU安全有效剂量的依据之一。
我院此项目纳入60例结直肠癌患者。5-FU高浓度组（AUC>40mg/L）的客观缓解率、疾病控制率低于低、中浓度组（AUC≤20mg/L和20~40 mg/L），且高浓度组患者疾病进展率是显著高于低浓度和中浓度组的患者，中浓度组患者客观缓解率、疾病控制率高于低浓度组，且疾病进展率低于低浓度组，差异具有统计学意义（P<0.001），表明中浓度组患者AUC在20~40 ug/ml范围其能得到较好的控制，降低患者疾病进展的几率；同时随着AUC增加，其骨髓抑制的发生率升高，高、中浓度组患者骨髓抑制反应发生率高。按骨髓抑制程度分级，Ⅰ~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级骨髓抑制反应程度在各组之间差异无显著性(P>0.05），但骨髓抑制的发生率是随着AUC的增加而呈增高趋势的；5-FU高浓度组（AUC>40mg/L）的患者Ⅲ级以上恶心呕吐反应的发生率是显著高于低、中浓度组（AUC≤20mg/L和20~40 mg/L），差异具有统计学意义（P=0.006）；腹泻、脱发以及手足综合征等不良反应随着AUC的增加，其发生率呈增高趋势，但病例数少，未能做统计学分析。表明5-FU稳态血药浓度与毒性反应（骨髓抑制、恶心呕吐反应）是呈正相关的。由以上结果可知，中浓度组患者治疗疗效效果高于低浓度组和高浓度组，而中浓度组患者毒性反应发生率和Ⅲ级以上毒性反应发生率低于高浓度患者。本试验结果显示，约82%的患者AUC高于目标值，仅约15%的患者能达到目标范围，部分患者高于警戒值，并且个体间存在较大的药代动力学差异。
与其它项目的区别在于：
1、有研究认为氟尿嘧啶AUC值应控制在20~30 mg/L，我们的研究得出的结论是AUC控制在20~40 mg/L时肿瘤能得到较好的控制，化疗副作用轻微。在中国人群中，单一追求国外文献报道的5-FU AUC20~30 mg/L并不恰当，应结合患者基因多态性、给药剂量、5-FU AUC、疗效与毒性反应等多个方面来评价中国人群中结直肠癌患者5-FU治疗浓度范围，有助于降低患者毒性反应的发生
2、既往没有研究分析氟尿嘧啶血药浓度监测值原因，本项目结合临床研究推测5-FU检测值偏高可能有以下原因：
（1）患者自身情况。
（2）是否正确给药患者使用静脉泵化疗时，泵入时间长达48小时，部分患者私自调整输液泵速度加快5-FU的输入速度从而使血液中药物浓度升高；
（3）化疗中存在合并用药结直肠癌患者在治疗时，合并使用多种辅助药物，其中可能存在药物的抑制和相互作用，如肿瘤科常用药西咪替丁、多潘立酮、氟喹诺酮类等。
（4）基因的多态性
（5）样本处理与保存
五、成果的创造性、先进性
1、5-FU的疗效、毒性反应、浓度及基因多态性四者是密切相关的，在临床药师的参与下，利用对大肠癌患者5-FU进行血药浓度监测，结合患者临床症状，探寻5-FU体内有效治疗浓度范围；
2、作为县级医院，研究5-FU中体内血药浓度、5-FU毒性反应与5-FU化疗疗效之间的关系，寻找能够指导个体化结直肠癌化疗的有效血药浓度；
3、通过对5-FU疗效及毒副作用的相关性分析，为临床医生在初始给药剂量等用药上提供更多信息，减少患者不良反应，为延长患者生存期积累经验；
4、临床药师参与患者的化疗全过程，为患者进行用药教育及用药监护；
六、作用意义（直接经济效益和社会意义）
经济效益：目前没有5-FU血药浓度监测的具体收费标准，大多数的研究都是临床研究阶段，尚未进入临床大规模应用。但是通过对血药浓度监测可以更好的监护患者的化疗毒副
社会意义：通过对患者5-FU进行血药浓度监测和5-FU关键酶系基因多态性分布研究，结合患者临床症状，寻找出基因多态性与5-FU血药浓度之间的关系以及基因多态性与患者毒性与疗效作用之间的关系，寻找能够指导个体化结直肠癌化疗的基因多态性敏感位点，应用于临床，使精准治疗和真正意义上的个体化给药成为可能。
七、推广应用的范围、条件和前景
应用范围、条件：
1、目前的样本量还是太少，缺乏大数据的研究，若想推广应用还需大数据支持；
2、5-FU在体内合成、分解、代谢受DPYD、UMPS和MTHFR的基因多态性影响，它们之间的关系还不是很明确，需要继续研究和大数据的支持，
3、监测对象也有一定的要求：患者应该是经病理证实为结直肠癌；且ECOG≤2分，预计生存期≥3个月；辅助化疗停止时间≥6个月或未进行过化疗；接受以氟尿嘧啶为主的化疗治疗；肝肾功能﹑血常规均达到化疗标准；年龄在30-75岁；至少有一个可测量的实体肿瘤
4、目前没有5-FU血药浓度监测具体的收费标准，若想推广必须出具收费标准，保障监测的可盈利性；
前景：个体化药物治疗将是未来药学发展的重要方向，此外临床药师下临床参与临床多学科诊疗模式也是现在临床的热点。5-Fu作为基础化疗药物用途广泛，对其进行治疗药物监护有必要也有前景。若加以细分，可以从以下方面深层次研究：
（1）5-Fu血药浓度与疗效和毒性反应关系将成为主要研究对象；
（2）5-Fu血药浓度与基因多态性研究也是未来的重要发展方向；
（3）建立5-Fu个体化治疗大肠癌最优方式，保障治疗过程药物有效性和安全性打下基础；
八、存在的问题和改进意见
1、方法的选择
5－FU 的检测方法有很多。 目前，国内外应用比较广泛的是高效液相色谱法 ( HPLC) 、高效液相质谱联用法( LC － MS /MS) 和免疫分析法。由于我院实验条件有限，我们检测5－FU血药浓度用的是传统高效液相色谱法（HPLC），在方法上还需改进。虽然HPLC法准确性高、灵敏度高、精密度好，但样品处理复杂，回收率低，检测时间长，给大量样本快速检测带来一定困难。相比而言用高效液相-质谱联用（LC－MS/MS）效果更好，特异性更高。LC－MS/MS此方法选用质谱检测器，可利用任一质荷比或多个质荷比的离子信号进行物质的浓度检测，具有血量少，样品处理过程简单，节省溶剂用量及检测时间短等优点。同时，高效液相和质谱联用后，分辨性能高，灵敏度高，分析速度快，是一种高特异性的检测方法。但存在仪器价格昂贵，操作人员专业技术要求高，不易普及等缺点。免疫分析法此方法以比浊法和5－FU单克隆抗体为基础开发而来。用于5－FU的定量检测，该方法结果呈线性，准确，灵敏，重复性好，曲线稳定性良好，测定结果与色谱法具有良好的相关性，且具备快速、样本需求量少、样本预处理简单和适用于全自动分析仪等优点，可能会促进5－FU血药浓度监测在临床中的开展。
2、样本的处理
二氢嘧啶脱氢酶（DPD是5-FU分解关键酶，主要存在于肝与外周血单核细胞中，约 80% 5-FU 经 DPD 作用分解代谢为非活性产物。全血是检测5-FU 浓度最理想的样本，但受外周静脉血中 DPD 影响，5-FU 在全血中不稳定。且患者血样采集时，受实验条件、临床采血及保存条件等影响，其血液样本是否及时分离，直接影响 5-FU 在全血中的稳定性。预试验发现，若采集血样在室温下放置超过1h 后再分离血浆，进样测定。结果显示，全血中的 DPD 可迅速将 5-FU降解。其降解速度可能与患者 DPD 酶水平相关。有研究表明， 当血浆置于 4 ℃及以下时，降解程度可降至最低。血浆中若无血细胞混杂或分离后立即冷冻，样本可保存数月以上，且 5-FU 不会发生降解。由于条件有限，本试验采集患者样本后，立即离心，然后存放于4℃冰箱，收集到一定数量后邮寄给外包公司检测。由于不是及时检测，不能完全保证血液中5-FU未出现降解，有待改进。