一、研究目标：

  本课题旨在通过免疫组化 SP 法检测 TRKC 及 NT-3 在结直肠癌组织中的表达情况，初筛出 TRKC 阳性表达的结直肠癌患者，进一步用荧光原位杂交检测 TRKC 阳性表达的肿瘤组织，以期检测出可能存在的 NTRK3 基因融合，而携有 NTRK3 基因融合的结直肠癌患者将从 TRK 抑制剂治疗中获益，这项工作的开展 将为 TRK 抑 制剂在结直肠癌患者中的运用提供理论依据。

 

 （2）纳入标准

初次诊断为结直肠癌； 术后病理结果证实为结直肠癌，正常组织无癌细胞浸润术前未接受过手术、放化疗、免疫治疗及其他抗肿瘤治疗有完整的临床病理资料

 （3）排除标准

因其他原因导致死亡的患者同时合并有其他恶性肿瘤复发或转移性结直肠癌

  二、实验分组

（1）将实验分为两组，一组是用免疫组化 SP 方法分别检测结直肠癌组织 中 TRKC 及其配体 NT-3 的表达，另外一组是检测 TRKC 及 NT-3 在癌旁正常组织 中的表达，分析 TRKC 及 NT-3 在这两种结直肠组织中表达的差异。

（2）分析 TRKC 及 NT-3 表达状态与 141 例结直肠癌患者临床病理参数之间 的关系。

（3）据免疫组化结果将 TRKC 及 NT-3 分为阴性表达组和阳性表达组，分析 TRKC 及 NT-3 表达与结直肠癌患者预后之间的关系。

三.技术路线图

 

本课题中的随访数据直接从医院结直肠癌数据库中提取。本课题中的终点 事件分别为 OS 和 RFS，随访截止日期为 2022 年 8 月 25 日。

五、统计学分析

  依据课题研究结果，用 SPSS26.0 软件及 Graphpad Prism9 进行统计学分 析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，Shapiro-wilk test 检验数据分 布情况，符合正态分布的数据两组之间的比较采用 t 检验，非正态分布数据两 组间的比较采用 Mann-Whitney 检验；用卡方检验分析 TRKC 及 NT-3 表达水平与 临床病理特征的关系，Kaplan Meier 法分析 TRKC 和 NT-3 表达水平与结直肠癌 预后的关系，COX 比例风险回归模型分析影响预后的因素。P<0.05 为差异有统 计学意义。

六、资料管理办法

项目一手临床资料采取谁入组谁收集，

1 个季度在项目负责人处汇总 1 次。

七、实验结果

（1）通过免疫组化检测 TRKC 在结直肠癌患者癌组织及癌旁正常组织中的表达情况，结果表明，TRKC 在结直肠癌癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义；运用卡方检验分析 TRKC 表达与患者临床病理特征之间的关系，发现 TRKC 的表达与患者的肿瘤部位（P<0.05）、淋巴结转移（P<0.05），TNM 分期（P<0.01），血清 CEA 水平（P<0.01）和血清 CA199 水平（P<0.05）相关；根据结直肠癌患者的随访信息进行 Kaplan meier 生存分析， 发现 TRKC 阳性表达组的患者总生存时间（overall survival，OS）和无病生存 期时间（progression-free survival，PFS）低于 TRKC 阴性表达组；

（2）通过免疫组化检测 NT-3 在结直肠癌患者癌组织及癌旁正常组织中的 表达情况，结果表明，NT-3 在结直肠癌癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常 组织，差异具有统计学意义；运用卡方检验分析 NT-3 表达与患者临床病理特征 之间的关系，发现 NT-3 的表达与患者的淋巴结转移（P<0.05），远处转移 （P<0.05），TNM 分期（P<0.05）和血清 CEA 水平（P<0.05）相关；根据结直肠癌患者的随访信息进行 Kaplan meier 生存分析，发现 NT-3 阳性表达组的患者 总生存时间（overall survival，OS）和无病生存期时间（progression-free survival，PFS）低于 NT-3 阴性表达组。

（3）我们将收集到的结直肠癌患者的临床病理特征及免疫组化测得的TRKC 表达以及 NT-3 表达情况运用 COX 比例风险回归模型进行单因素分析（表 2）， 结果显示性别（HR=0.441, P<0.05），年龄（HR=2.350, P<0.05），吸烟（HR=2.067, P<0.05），淋巴结转移（HR=2.439, P<0.01），远处转移（HR=4.650, P<0.01）， TNM 分期（HR=2.639, P<0.01），血清 CA199（HR=2.738, P<0.01）,TRKC 表达 （HR=0.997, P<0.0001）和 NT-3 表达（HR=0.428, P<0.01）与患者的不良预后 相关。我们进一步将单因素分析中具有统计学意义的指标纳入到多因素分析模 型（表 3），结果显示 TRKC 表达情况（HR=2.697, P<0.01）和 NT-3 表达情况 （HR=0.433, P<0.05）能够作为结直肠癌患者不良预后的独立预测指标。

八、项目技术的关键

免疫组化染色过程中涉及许多不确定环节，多种因素可以影响染色结果，最终可能出现非常的假阴性或假阳性现象，干扰对染色结果的判断。检测前，组织的处理、固定的时间及方式、检测方法的验证，试验过程中，实验步骤及抗原的修复及暴露，试验过程中对温度及时间的把控，以及试验后对免疫组化的试验结果的判读都是该项目的技术关键。技术难点是：试验过程中抗原的修复。创新点：目前关于 TRKC 在结直肠癌中的表达与预后研究较少，NTRK3 基因融合在结直肠癌中的发生率尚未见报道，因此本项研究内容新颖。超越任务书的情况说明：我院在曾凡新副院长的带领下，于 2018 年 3 月至 2018 年 9 月期间建立了结直肠癌患者数据库，数据库中结直肠癌患者样本量高达 700 例，该数据库包含了结直肠癌患者的一般情况信息、病理资料、以及肿瘤标志物、影像学检查结果、治疗信息、术后随访信息。同时拥有 1 万张结直肠癌组织病理切片，原计划收集病例 100 例，在试验过程中，由于样本量充足，最终纳入 141 例病例。

  九、推广应用前景分析

调查 TRKC 在结直肠癌中的表达情况，分析其表达与患者临床病理参数及预后之间的关系，同时由于 NTRK 基因融合在结直肠癌中的发生率非常低，需通过简单、快速、经济的免疫组化方法来初筛 TRKC 阳性表达的肿瘤，为进一步运用荧光原位杂交或二代测序技术检测结直肠癌中 NTRK3 基因融合提供指导，以期为结直肠癌的患者提供具有个性化的治疗方式。存在的问题及下一步的打算：本研究结果提示 TRKC 和 NT-3 可能在结直肠癌的发生发展过程中起重要作用，为深入研究结直肠癌的不良预后标志物以及靶向治疗提供了新的思路和靶点。但本研究尚存在一定的局限性，仅验证了 TRKC 和 NT-3 蛋白水平的表达，未来可通过生物信息学分析，利用 TCGA 结直肠癌数据库或收集结直肠癌根治手术新鲜结直肠癌组织及癌旁正常组织去验证其 mRNA 及蛋白表达水平；同时，使用结直肠癌癌细胞系进行体外实验结合动物实验以深入研究 TRKC 和 NT-3 在结直肠癌发生发展过程中的具体作用及其相关机制，为结直肠癌的临床治疗和不良结局预防开辟新途径。由于项目时间关系，我们尚没有运用荧光原位杂交或二代测序技术检测结直肠癌中 NTRK3 基因融合，下一步我们将继续完成后续的二代测序技术，检查结直肠癌中 NTRK3 基因融合的情况。同时，在实验过程中，由于工作人员临床工作繁忙，导致我们在实验中对 于数据整理缺乏随时收集随时记录，以及专人管理，导致最后在整理数据上花 了大量的精力及时间，同时对于某些异常数据未能及时发现及处理，导致部分实验结果丢失。在以后的实验中，我们应该设置专人管理，2 周小总结，1 月大总结，通过及时的数据整理发现实验过程中的不足，及时整改。